Replicazione del DNA

Quando Watson e Crick proposero il loro modello della doppia elica di DNA capirono che, se il loro modello era corretto, la replicazione del DNA sarebbe stata ovvia. Cioè, se la molecola di DNA era srotolata e le due eliche erano separate, ogni elica avrebbe potuto essere lo stampo per la sintesi di un nuovo filamento complementare di DNA. Questo modello di replicazione del DNA è noto come modello semiconservativo, poiché ogni molecola figlia mantiene una delle due eliche parentali. A quei tempi erano stati proposti altri due modelli per la replicazione del DNA, il modello conservativo e il modello dispersivo. Nel modello conservativo, le due eliche di DNA parentali rimangono insieme si associano dopo la replicazione e nell’insieme funzionano da stampo per la sintesi di nuove doppie eliche di DNA figlie. Così, una delle due molecole di DNA figlie e in realtà la doppia elica parentale, mentre l’altra consiste tutta di nuovo materiale. Nel modello dispersivo, la doppia elica parentale viene tagliata in segmenti di DNA a doppia elica che funzionano da stampo per la sintesi di nuovi segmenti di DNA a doppia elica. In qualche modo, i segmenti seri associano in doppie eliche complete di DNA, con segmenti parentali ,e segmenti i figli mescolati. Così, quantunque di due molecole figlie di DNA siano identiche e rispetto la sequenza di coppie di basi, il DNA parentale è stato in realtà disperso in entrambe le molecole figlie. Logicamente è difficile immaginare come le sequenze di DNA dei cromosomi possono essere mantenute uguali con un meccanismo del genere.

1. Inizio della replicazione

La replicazione del DNA procariotico e virale generalmente inizia in una zona specifica del cromosoma, l’origine di replicazione. In questa regione la doppia elica si denatura formando dei singoli filamenti ed esponendo le basi per la sintesi di nuove eliche. La denaturazione localizzata del DNA produce quella che viene chiamata una bolla di replicazione, cioè una regione del cromosoma dove il DNA è a singola elica e dal quale la replicazione procede in modo bidirezionale. I segmenti di singole eliche srotolati su cui vengono sintetizzate le nuove liriche sono chiamati eliche stampo (filamenti stampo). Nel cromosoma circolare di E.coli vi è una sola origine di replicazione, chiamata oriC, da cui la replicazione procede bidirezionalmente.

Per prima cosa, la girasi (un tipo di topoisomerasi) rilassa il DNA superavvolto. Quindi, le proteine iniziatrici si legano alla molecola di DNA parentale in corrispondenza della sequenza di origine della replicazione. Le proteine iniziatrici si avvolgono attorno al DNA a formare un grosso complesso. La DNA elicasi si lega alle proteine iniziatrici e viene portata sul DNA. La DNA elicasi svolge il DNA, utilizzando come energia di attivazione quella derivata dall’idrolisi di ATP. L’idrolisi dell’ATP determina un cambiamento nella struttura dell’elicasi, che consente all’enzima di muoversi lungo la singola elica e di svolgere la doppia elica di DNA man mano che procede. Successivamente, l’enzima DNA primasi, si lega all’elicasi, formando un complesso detto primosoma. La primasi è importante nella replicazione del DNA, perché nessuna delle DNA polimerasi note può iniziare la sintesi di un filamento di DNA; esse possono solo aggiungere nucleotidi ad un filamento preesistente. La primasi è attivata dalla DNA elicasi, e sintetizza un corto filamento di RNA primer, al quale possono essere aggiunti dalla DNA polimerasi nuovi nucleotidi, e la prima nuova catena di DNA è fatta. I primer incominciano con due nucleotidi purinici, più frequentemente AG. I parametri di RNA sono successivamente rimossi e sono rimpiazzati con DNA. Il primer è un corto segmento di nucleotidi legato all’elica stampo che serve come substrato per l’azione della DNA polimerasi, che allunga il primer a formare una nuova elica di DNA, la cui sequenza è complementare all’elica stampo.

2. Allungamento

Quando una molecola di DNA a doppia elica si srotola per esporre i due filamenti stampo a singola elica per la replicazione del DNA, si forma una struttura a forma di Y che viene chiamata forca replicativa. Quando il DNA si srotola nel mezzo di una molecola di DNA (come per esempio può succedere in un cromosoma circolare), ci sono due forche di replicazione (ricordiamo che ciascuna forca replicativa si muove in una sola direzione). Queste due forche possono essere viste come due lettere “Y” unite insieme nella loro parte superiore. Molto frequentemente ciascuna forma risulta attiva e per questo la replicazione del DNA procede in modo bidirezionale.

L’elicasi svolge il DNA e produce eliche stampo a singolo filamento. Le proteine SSB (Proteine che legano DNA a singola elica) si legano al DNA a singola elica, stabilizzandolo e impedendo che rinaturi (cioè evitando l’appaiamento delle basi, che ripristinerebbe la doppia elica). Dopo questo primo avvenimento la DNA primasi sintetizza un primer di RNA su ciascuna elica stampo. Questi primer di RNA vengono allungati dalla DNA polimerasi III, che sintetizza nuove catene di DNA complementari al filamento stampo, spostando contemporaneamente le proteine SSB legate.

Ricordiamo che la DNA polimerasi può catalizzare la sintesi di DNA solo in direzione 5′–>3′, mentre le due eliche sono di polarità opposta. Per mantenere la polarità 5′–>3′ della sintesi del DNA ed una sola direzione di movimento della forca replicativa, il DNA è fatto in direzione opposte sulle due eliche stampo. La nuova elica che è fatta in direzione 5′–>3′ nella stessa direzione nella quale si muove la forma replicativa è detta elica guida o elica leading (leading strand), mentre la nuova elica che viene fatta nella direzione opposta al movimento della forca replicativa è chiamata elica in ritardo o elica lagging (laggin strand). Perla sintesi della leading strand basta un solo primere di RNA, mentre la sintesi dell’elica lagging richiede tutta una serie di primer di RNA.

Man mano che la forca di replicazione procede, l’elicasi svolge altro DNA. La girasi (una forma di topoisomerasi) allenta la tensione prodotta nel DNA a monte della forca replicativa. Sullo stampo dell’elica leading, lealica leading è sintetizzata in modo continuo seguendo la forma replicativa. Dato che la sintesi del DNA può procedere soltanto in direzione 5′–>3′, tuttavia, la sintesi dell’elica lagging può procedere solo fino ad un certo punto. Perché la replicazione del DNA procede sullo stampo dell’elica lagging, deve avvenire un altro inizio di sintesi di DNA. La primasi, ancora attaccata all’elicasi in corrispondenza della forca replicativa fa un nuovo primer di RNA. La DNA polimerasi aggiunge quindi nuovo DNA al primer di RNA e produce un nuovo frammento di DNA. Visto che l’elica leading viene fatta in modo continuo, mentre l’elica lagging può essere fatta soltanto un pezzo alla volta, cioè in modo discontinuo, complessivamente la replicazione del DNA avviene in maniera semidiscontinua (oltre che semiconservativa). I frammenti di elica lagging fatti secondo questo processo sono chiamati Frammetni di Okazaki. Il processo che abbiamo analizzato prosegue nel tempo. Quindi, l’elicasi srotola il DNa, si ha sintesi continua di DNA sullo stampo dell’elica leading e sintesi discontinua di DNA sullo stampo dell’elica lagging. I frammenti di Okazaki sintetizzati uno dopo l’altro sullo stampo dell’elica lagging vengono successivamente congiunti in un filamento continuo di DNA. Questo processo richiede l’attività di due enzimi, la DNA polimerasi I e la DNA ligasi. Considerate due frammenti di Okazaki adiacenti: l’estremità 3′ del frammento più nuovo è adiacente, ma non legata, all’estremità 5′ del primer del frammento sintetizzato prima. La DNA polimerasi III lascia il DNA e la DNA polimerasi I continua la sintesi i direzione 5′–>3′ del frammento di DNA, rimuovendo contemporaneamente la porzione del primer del frammento più vecchio per effetto della sua attività esonucleasica 5′–>3′. Quando la DNA polimerasi I ha completato la sostituzione dei ribonucleotidi del primer con desossiribonucleotidi, rimane un’interruzione a singola elica fra i nucleotidi adiacenti dei due frammenti dell’elica. I due frammenti sono uniti dalla DNA ligasi, a formare un’elica di DNA più lunga. L’intero processo si ripete finchè non viene replicata l’intera molecola di DNA.